PCR-RFLP 反應(yīng)

PCR反應(yīng)體系:在 200ul離心管中進(jìn)行，反應(yīng)總體積為30ul， 反應(yīng)體系包括2XPCR預(yù)混液15ul,鑒別引物(30umol/L)各0.5ul,模板 l ul，無(wú)菌超純水13ul。將離心管置PCR儀，PCR反應(yīng)參數(shù):95°C 預(yù)變性4分鐘，循環(huán)反應(yīng)30次(95°C 30秒，55?58°C ，72°C 3 0 秒 )，7 2 °C延 伸 5 分 鐘 。 取 P C R 反 應(yīng) 液 ，置 500ul離心管中，進(jìn)行酶切反應(yīng)，反應(yīng)總體積為20ul，反應(yīng)體系包括10X酶切緩沖液2ul,PCR反應(yīng)液6ul，Sma I(10U/M1) 0.5ul，無(wú)菌超純水11.5ul,酶切反應(yīng)在30°C水浴反應(yīng)2小 時(shí)。另取無(wú)菌超純水，同法上述PCR-RFLP反應(yīng)操作，作為空白對(duì)照。

電泳檢測(cè)照瓊脂糖凝膠電泳法(中國(guó)藥典2020年版通則0541)

膠濃度為 1.5%，膠中加入核酸凝膠染色劑GelRed;供試品與對(duì)照藥材 酶切反應(yīng)溶液的上樣量分別為8ul, DNA分子量標(biāo)記上樣量為 l ul (0.5ug/ul)。電泳結(jié)束后，取凝膠片在凝膠成像儀上或紫外透射儀上檢視。供試品凝膠電泳圖譜中，在與對(duì)照藥材 凝膠電泳圖譜相應(yīng)的位置上，在100?250bp應(yīng)有兩條DNA 條帶，空白對(duì)照無(wú)條帶。