無乳鏈球菌（Strep. agalactiae）和金黃色葡萄球菌（Staph. aureus）被認為是奶牛乳腺炎的重要傳染性病原，然而這兩種病原最近都從奶牛乳房外和環境中分離出來，表明除乳房以外的其他部位可能有這兩種病原傳播并導致乳房內感染。可以使用檢測乳房外部位病原的診斷方法，但診斷方法仍需要驗證。本研究的目的是評價丹麥 Mastit4 qPCR檢測試劑盒和細菌培養 (BC) 方法在來自牛奶和乳頭皮膚樣本中檢測無乳鏈球菌（Strep. agalactiae）和金黃色葡萄球菌（Staph. aureus）中的靈敏度(Se) 和特異性 (Sp)比較。從具有自動擠奶系統的8個無乳鏈球菌陽性的丹麥奶牛場中隨機選擇了 30-40 頭體細胞計數高的奶牛，從右后方 (n = 287) 收集乳頭皮膚樣品和無菌牛奶樣品用于細菌培養和 qPCR 檢測分析，靈敏度(Se) 和特異性 (Sp)采用貝葉斯統計分析來評價。對于牛奶樣品，無乳鏈球菌 qPCR檢測的靈敏度(Se) 和特異性 (Sp)分別為 0.97 和 0.99，而細菌培養的靈敏度(Se) 和特異性 (Sp)分別為 0.41 和 1.00。 金黃色葡萄球菌的靈敏度(Se) 和特異性 (Sp)分別為0.95 和 0.99，而傳統細菌培養的靈敏度(Se) 和特異性 (Sp)分別為 0.54 和 0.77。對于乳頭皮膚樣本，無乳鏈球菌 qPCR檢測的靈敏度(Se) 和特異性 (Sp)分別為 0.97 和 0.96，而傳統細菌培養的靈敏度(Se) 和特異性 (Sp)分別為 0.33 和 1.00。金黃色葡萄球菌的靈敏度(Se) 和特異性 (Sp)分別為0.94 和 0.98，而傳統細菌培養的靈敏度(Se) 和特異性 (Sp)分別為 0.44 和 0.74。總之，用于檢測無乳鏈球菌（Strep. agalactiae）和金黃色葡萄球菌（Staph. aureus）qPCR試劑盒靈敏度(Se)比細菌培養方法要高，這表明 qPCR方法是一種有價值的方法，可用于檢測牛奶樣品中的這兩種病原。細菌培養法與 qPCR方法相比，細菌培養法在檢測乳頭皮膚上的無乳鏈球菌（Strep. agalactiae）和金黃色葡萄球菌（Staph. aureus）方面的性能較差，這表明在將這兩種方法作為乳頭皮膚定植菌的常規檢測方法時，應考慮兩種方法的目標條件的差異。細菌培養發的低靈敏度可能會妨礙使用細菌培養進行皮膚檢測，而 qPCR方法更適合這項檢測。