基因分型技術新突破：Allegro靶向基因分型技術詳解

基因分型（Genotyping）是利用分子生物學方法檢測生物個體基因型的技術，在醫學和農業生產中，具有廣泛的應用價值：在農業領域，常用于進行形狀基因的精細定位、分子輔助育種、種質資源鑒定等等；醫學領域常用于分析診斷疾病導致的遺傳變異，分子遺傳機制、易感性位點篩選及藥物敏感位點篩選等。

目前常用的基因分型手段主要是基于NGS的簡化基因組方法，包括GBS、RAD、ddRAD等，這些簡化基因組方法都能夠提供開放、無偏差的基因分型，但卻沒有一種技術可以實現針對靶向基因區的高效分型——單基因、基因家族、啟動子和增強子、基因簇及非編碼基因等都可能含有重要的與表型變異密切相關的多態性。因為傳統的簡化基因組技術，由于其以隨機的方式研究遺傳變異，獲取的信息大部分在這些區域之外，就導致了有價值標記的檢測缺失。雖然經典的微陣列的方法可以規避這一缺漏，但卻存在著當基因池改變時會出現較強的檢測偏差和較差的可重復性問題。

讓我們來了解一種兩全其美的新方法：

Allegro靶向基因分型，提供了一種快速、可擴展、高效經濟的單引物富集技術（SPET），基于新一代測序技術對各類生物樣本的特異性靶向區域SNP進行有針對性的測序分型。該方法可以通過捕獲每個靶向測序序列的SNP特異性數據點，提供豐富有效的測序數據，不僅有效獲得靶向區分型結果，更可以快速構建具有可擴展性及低成本單SNP位點檢測流程。

技術流程如下：

1. 將基因組酶切打斷，該步驟操作便捷，可實現自動化；

2. 將片段化的基因組接上indexed adaptor ，DimerFree技術可消除接頭二聚體的形成;

3. 針對靶向區域設計的探針捕獲目標區域捕獲；

4. 擴增后獲得靶向區域序列文庫，測序后得到分型結果。

Allegro靶向基因分型通過探針設計及“雞尾酒”式的酶切組合進行基因組片段化，能夠有效地將SNP控制在測序讀長范圍內，輔以優化過的探針設計，確保SNP可通過單端測序測序模式檢出。退火位點的設計也規避了已知多態性位點的位置，以確保擴增過程不會因此而造成偏倚。如果選擇雙端測序測序，還可在read 2中獲得新的未知多態性位點信息，充實研究結果（下圖）。

Allegro靶向基因分型的優勢如下：

• 方便在自動化工作站上建庫
• 設計靈活
• 可擴展復用
• 檢測準確
• 集成了酶促打斷
• 低起始量（10 – 1100 ng）
• 高檢測通量（100 – >100,000 SNPs）
• 建庫周期短（<24 h）

截至目前，已有包括人，動物，植物在內的多個物種開展了基于SPET技術的基因分型。

今天跟大家分享的是該技術在黑楊及玉米的研究中的應用實例：

為了評估SPET技術的分型效果及技術性能，研究對10個玉米株系（5個近交系 F7, H99, HP301, Mo17, W153R; 5個雜交F1：A632XB73, B73XF7, W153RXHP301, B73XB96, B73XMo17）同時開展了基于illumina MaizeSNP50芯片分型的研究和SPET分型，并對540株黑楊構成的自然群體進行SPET分型及Panel分型研究，以獲得與生物量表型相關的位點信息。

玉米研究中發現，全部樣本中目標位點的覆蓋度十分相似（約50×，下圖A），通過提高覆蓋度閾值，檢測的準確性有改善，在50×到達的平臺期后，準確率可達97.2%（下圖B）。分析結果比較顯示，無論在準確度和可重復性方面，自交系個體都比雜交系個體呈現更好的結果（下圖C、D）

針對黑楊的大規模基因分型研究中，采用SPET技術，靶向實現了目標區域的捕獲分型，共捕獲靶向位點數66922個，并且在非靶向區域內獲得了453170個非靶向多態性位點。等位基因頻率研究發現，目標區域位點等位基因頻率在一定程度上與應用的選擇標準有關（下圖），de novo方法側重*或極低的等位基因頻率。

對不同方法獲得的SNP分型結果進行樣本間聚類，發現de novo方法可增強樣本群體間聚類的性能，更好的體現出差異性類群。（下圖）

綜上，Allegro靶向基因分型的SPET技術一次性突破了舊基因分型技術的瓶頸，將靶向捕獲研究與可拓展性的簡化基因組相結合，是一種可靠高效低成本的基因分型技術流程。在實現了可拓展研究的同時，縮減了實驗耗時。這些優勢彌補了此前微陣列技術和簡化基因組技術的不足，為大規模群體的穩定靶向基因分型提供了具有高性價比的技術手段。

主要參考文獻：

Single primer enrichment technology as a tool for massive genotyping: a benchmark on black poplar and maize. ANNALS OF BOTANT, 2019.